Control de Calidad en scRNA-Seq

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# Control de Calidad en scRNA-Seq
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### Dra. Evelia Coss 07 de agosto de 2023
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# Enfoques o Ideas principales

Detectar **células verdaderas y de alta calidad** ✅🍪, de modo que cuando agrupemos nuestras células sea más fácil **identificar poblaciones de tipos celulares distintos**.

Identificar las **muestras fallidas** e intentar **salvar los datos o eliminarlas** del análisis, además de intentar comprender por qué falló la muestra.

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# ¿Por qué hay problemas con los datos?

- Problemas con el rompimiento de las células
- Fallos en la preparación de las bibliotecas (ineficiencias en la transcripción inversa, amplificacion por PCR, etc).
- Más de una célula durante la secuenciación (douplets o multiplets).
- Problemas en el alineamiento.

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# Preguntas Básicas

Se responden durante el análisis de Single-cell RNA-Seq.

- ¿Cuántos droplets traen más de una célula? (douplets 🍪🍪 o multiplets 🍪🍪🍪). 
- ¿Cuántas células murieron durante el proceso de secuenciacion?

Cada **droplets** debe contener una **sola célula** 🍪.

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# Ejemplo del contenido

Figura obtenida de [Single-Cell best practices](https://www.sc-best-practices.org/preprocessing_visualization/quality_control.html).

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# La mala calidad en los datos puede ser debida a varios factores

Una o varias células podemos encontrar:

- ⚠️ Baja cantidad de cuentas totales
- ⚠️ Baja cantidad de genes expresados
- ⚠️ Alta proporción de cuentas (reads) provenientes de la mitocondria
- ⚠️ Alta proporción de cuentas provenientes de las secuencias control (ERCC spike-in control transcripts)

Mas informacion sobre [ERCC spike-in control transcripts](https://www.agilent.com/cs/library/applications/ERCC%20Spike-in%20App%20Note%205994-1767EN_1.7.pdf).

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# Recomendaciones

* Tener un correcto diseño experimental (evitar efecto *bash*). 👾
* Correcta preparación de las muestras. 🎮
* Analizar la calidad de los datos. 🍪

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# Tipos de filtros

- **Fixed thresholds:** Valores de corte fijos y estrictos (FDR < 0.5) ♠️
- **Adaptative thresholds:** Valores de cortes adaptados al comportamiento de nuestros datos.♦️

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# Parámetros empleados para evaluar la calidad con la función `addPerCellQC`

- `sum`: Número de cuentas (lecturas) totales de cada célula.
- `detected`: Genes expresados con al menos una cuenta.
- `altexps_ERCC_percent`: Porcentaje de cuentas mapeadas de las secuencias control (ERCC spike-in control transcripts).
- `subsets_Mito_percent`: Porcentaje de cuentas mapeadas provenientes de la mitocondria.

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# Ejemplo: linea celular 416 en ratón

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# Actividades contempladas

Realizaremos las siguientes actividades con este ejemplo:

- Eliminar células de baja calidad.
- Comparar entre los tipos de filtros (Fixed thresholds y Adaptative thresholds).
- Filtrar células baja calidad
- Visualización de datos crudos y filtrados

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# Contenido de los datos

Línea celular de células mieloides progenitoras inmortalizadas de ratón usando [SmartSeq2](https://osca.bioconductor.org/lun-416b-cell-line-smart-seq2.html).

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# 1. Paquetes e Importar los datos en R

```r
library(scRNAseq) ## para descargar datos de ejemplo
library(DropletUtils) ## para detectar droplets 
library(Matrix) ## para leer datos en formatos comprimidos
library(AnnotationHub) ## para obtener información de genes
library(scater) ## para gráficas y control de calidad
library(BiocFileCache) ## para descargar datos
```

Cargar los datos empleando el paquete `scRNAseq`

```r
sce.416b <- LunSpikeInData(which = "416b")

# Conversion a factor, evitemos mensajes de error
sce.416b$block <- factor(sce.416b$block)
```

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# Anotación de genes

```r
ah <- AnnotationHub()
query(ah, c("Mus musculus", "Ensembl", "v97"))
# Anotacion de genes con la localizacion de cada cromosoma
ens.mm.v97 <- ah[["AH73905"]] # solo un cromosoma
location <- mapIds(ens.mm.v97, keys=rownames(sce.416b),
 keytype="GENEID", column="SEQNAME")
# deteccion de genes mitocondriales
is.mito <- which(location=="MT")
```

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# Análisis de calidad con `addPerCellQC`

```r
# Agregar la informacion de la calidad 
#por cada gen y celula en un mismo archivo
# Identificar genes mitocondriales
sce.416b <- addPerCellQC(sce.416b,
 subsets = list(Mito = is.mito)
)
sce.416b
```

Podemos observar la informacion de este data frame usando `colData`:

```r
# observar la informacion contenida en el dataframe
colData(sce.416b)

# Ver el nombre de las columnas
colnames(colData(sce.416b))
```

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# Contenido del archivo

Al imprimir la variable `sce.416b` podemos observar que es de tipo *SingleCellExperiment*.

Podemos ver el nombre de las columnas.

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# Preguntas sobre los datos

- ¿Cuántas células detectadas se encuentran en el dataframe `sce.416b`?
- ¿Cuántos genes fueron analizados con almenos una cuenta?

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# Visualización de los datos crudos

Genes detectados en cada uno de los bloques de secuenciación.

```r
plotColData(sce.416b, x = "block", y = "detected")
```

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# Evaluando los tipos de filtros

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# Visualizacion grafica de las celulas de buena calidad

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# Visualizacion grafica de las celulas de buena calidad

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# Identificando droplets vacíos con datos de PBMC

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# Conceptos basicos

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# Identificando droplets vacíos

Descripción gráfica la tecnología Next GEM de 10x Genomics. Fuente: [10x Genomics](https://www.10xgenomics.com/technology).

Opciones algorítmicas para detecar los droplets vacíos. Fuente: [Lun et al, _Genome Biology_, 2019](https://doi.org/10.1186/s13059-019-1662-y).

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# ¡Gracias! 
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